In questo secondo periodo Vespasiano si fregia del titolo di Marchese di Sabbioneta (Diploma dell'Imperatore Massimiliano II d'Absburgo dato in Vienna il 5.V.1565), oltre che di quelli già utilizzati nel periodo precedente di Principe del Sacro Romano Impero e di Conte di Rodigo.
Nel 1566 morì la zia Giulia Gonzaga.
Nel 1567 morì anche la seconda moglie Anna d'Aragona.
Nel 1568 contribuì in modo determinante alla definitiva pacificazione del Feudo di Casale Monferrato in nome e per conto di Guglielmo Gonzaga, Duca di Mantova.
Dal 1568 al 1570, salvo brevi periodi, risiedette stabilmente presso la Corte Spagnola.

Va notato che lo stemma araldico presente sulle monete conosciute di questo periodo, interzato in palo, è del tipo Spagna-Colonna-Gonzaga. La collocazione dell'Arme di Spagna nella partizione d'onore potrebbe rappresentare una sorta di omaggio all'illustre casato della moglie segnalando altresì in modo inequivocabile che gli interessi di Vespasiano erano principalmente rivolti al mondo spagnolo.

D'altro canto l'esame dei sigilli usati nella corrispondenza di Vespasiano in questo periodo, mostra che dopo la morte di Anna (non essendovi più ragione per lasciare l'Arme di Spagna nella partizione d'onore) venne adottato uno stemma araldico interzato del tipo Gonzaga-Colonna-Spagna. Ciò induce a ritenere che possa essere ulteriormente ristretto il periodo di coniazione delle monete conosciute di questo periodo fra gli anni 1565 e 1567.